1、转基因巨型小鼠,第3节 基因工程与转基因生物,是由普林斯顿大学的华裔科学家钱卓为首的一批科学家研究出来的。通过给老鼠植入一种额外基因NR2B，从而产生一种为NMDA的蛋白质。“杜奇老鼠”的记亿力比普通老鼠高出4至5倍。,聪明鼠“杜奇” :,聪明鼠“杜奇” 诞生的意义？,1993年，科学家培育出转基因抗虫棉，使我国第二个拥有抗虫棉自主知识产权的国家 。,转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,棉花植株(有抗虫特性),转基因抗虫棉的培育程序：,将重组DNA导入选育棉花细胞内,需要三种工具：,限制酶（切割DNA）DNA连接酶(连接DNA和运载体)运载体
2、(常为质粒),检测和鉴定抗虫基因在该棉花细胞中表达,切割DNA的工具限制性核酸内切酶,专一性能识别双链DNA 分子的某些特定脱氧核苷酸序列，并且切断其中特定部位 的两个脱氧核苷酸之间的键。例如：,特点：,限制异源DNA的入侵并使之失去活力，对自身的DNA无损害作用。,限制酶切割时产生黏性末端，DNA双链不在同一处断开，产生的片段带有数个碱基尾巴。,DNA连接酶,广泛存在于：细菌、噬菌体、酵母菌、植物和动物细胞内。 作用：将断裂的DNA黏性末端连接起来,基因工程的运载体质粒,概念：独立于细菌拟核DNA外的，能自主复制的双链闭环的DNA分子。 质粒DNA分子含有特殊遗传标记基因，如：抗四环素抗性基
3、因抗青霉素抗性基因,基因工程基因工程是指依据预先设计的蓝图，用人工方法将某种生物的基因，接合到另一种生物的基因组DNA中并使其表达，是后者获得新的遗传性状，产生出人类所需要的产物，或创造出新的生物类型的现代生物技术。,在宿主细胞内可以独立复制，也可以接合到宿主细胞的DNA分子中,二、基因工程的基本步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建（目的基因与运载体重组）,3、重组DNA分子导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定（筛选含目的基因的受体细胞）,目前广泛提取使用的目的基因有：抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,一、目的基因的获取,可从自然界已有的物
4、种分离， 也可用人工方法获取。,获取目的基因,目的基因是人们为了得到其表达产物而把它转入到 新的生物体中去的基因,1、目的基因主要指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）化学方法人工合成,未知序列,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库概念,2.基因文库类型,（包含一种生物的所有基因）,（包含一种生物的一部分基因）,（cDNA文库）,（未知序列）,基因组文库与部分基因文库的关系,3.基因组文库的构建,
5、提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段 与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因组文库的构建模式图,通过对 受体菌 的培养而储存基因,4.cDNA文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体 连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA 聚合酶,导入受体菌 中储存,（反转录法）,以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。,思考,为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有
6、这种生物的部分基因？,1、某个时期的发育是基因选择性表达的结果2、 mRNA 不含原DNA中内含子，反转录所得DNA无内含子,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,1、概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,3、条件：,2、原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,(二)利用PCR技术扩增目的基因,模板,（目的基因）,原料(脱氧核苷酸),引物（一小段单链DNA）,热稳定DNA聚合酶（耐高温）,温度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,（已知序列）,PCR技术,PCR扩增仪,以_方式扩增，即_（n为
7、扩增循环的次数）,指数,2n,5、扩增形式,在短时间内大量扩增目的基因,6、扩增结果,7、过程：,a、变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物开始进行碱基互补配对，合成与 模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,过程,变性、退火、延伸三步曲,利用PCR技术扩增目的基因动画演示,思考？,1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次， 理论上至少需要几个引物？,2（2n-1）(n为循环次数),（24-1）2=30,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱
8、基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,（三）人工合成法,DNA合成仪,推测,推测,合成,1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,（序列已知）,2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因,3、过程：,1、若未知目的基因的核苷酸序列，可采用_,总结：获取目的基因的三种方法应用,1、若知道目的基因两端的核苷酸序列，且基因比较大，可采用_,2、若已知目的基因序列，且基因比较小，
9、可采用_,PCR技术扩增,化学方法人工合成,从基因文库获取的方法,提取目的基因的方法与比较,二：基因表达载体的构建基因工程的核心,1,目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,载体与表达载体的区别：均有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体比载体增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,注意!,用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接
10、酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。,启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,3.基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口 四个黏性末端,DNA连接酶,基因表达载体 （重组DNA分子或重组质粒）,同一种,一个切口 两个黏性末端,三、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因导入受体细胞的方法,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载
11、体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,（受体细胞：体细胞）,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物中较常用,适用于单子叶植物,基因枪法,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精
12、卵发育,新性状动物,常用受体细胞：,受精卵,3 将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 常用菌：大肠杆菌 常用法：Ca2+处理（获得感受态细胞）（增大细菌细胞壁的通透性） 过程：,Ca2+处理 大肠杆菌,感受态细胞,感受态细胞吸收DNA,表达载体 与感受态 细胞混合,从细胞器的功能分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，能否用大肠杆菌？ 【提示】 不能，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌为原核生物，不含有这两种细胞器。,问题,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法
13、,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原-抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,成功导入概率极小，实际能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测和筛选,问题,问题,1）有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,2、下列有关基因工程技术的正确叙述是-（ ）细菌质粒是基因工程常用的运载体所有的限制酶都
14、能识别同一种特定的核苷酸序列选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达A. B. C. D. ,C,3、与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是-（ ）A反转录酶 BRNA聚合酶 CDNA连接酶 D解旋酶4限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键 是-（ ）AG与A之间的键 BG与C之间的键CA与T之间的键 D磷酸与脱氧核糖之间的键,C,D,三、基因工程的类型,按转入的外源基因所在的表达系统 分为：,微生物基因工程,植物基因工程,动物基因工程,特点：操作较容易，研制周期较短，通过发
15、酵大量生产 成果：药用蛋白质的规模化生产,例如：胰岛素依赖性糖尿病人胰岛素肢端肥大症 人生长激素释放抑制因子肺气肿 抗胰蛋白酶恶性肿瘤 白细胞介素溶血栓 组织型纤溶酶原吉活剂抗肿瘤 肿瘤坏死因子,微生物基因工程,微生物基因工程生产胰岛素,我国生产的部分基因 工程疫苗和药物,胰岛素、生长激素、干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，为提高人类的健康水平发挥了重大作用。,基因工程得到的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解多种毒害物质。
16、,植物基因工程,成果：培育出抗性植物，如：我国的转基因抗虫棉。全世界有近200种转基因植物，我国有抗病毒烟草、 耐储存转基因番茄。正在研究将预防乙型肝炎、龋齿等疾病的疫苗基因转入植 物，培育植物疫苗，以期通过食物获得疫苗接种。,转鱼抗寒基因的番茄,不会引起过敏的转基因大豆,动物基因工程,特点： 以受精卵作为受体细胞用显微注射的方法将目的基因导入受精卵使受精卵发育成转基因动物,成果： 巨型小鼠（内含外源生长激素基因）,（1）生产人源性蛋白质药物-乳腺生物反应器：将所需要基因转入乳量高的牛、羊等家畜体内， 从动物的乳汁中获得人源性蛋白质药物。,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),可以培育生产
17、人源性蛋白质药物的动物（即动物基因工程培育的乳腺生物反应器）,转基因山羊,1998年初，上海医学遗传研究所报道：中国科学家已经获得5只转基因山羊。其中一只母山羊的乳汁中，含有治疗血友病的药物蛋白有活性的人凝血因子。,（2）获取具有优良性状的动物新品种,耐不良环境的转基因鱼,1.以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,2.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,
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