1、 1 生物技术实践知识梳理生物技术实践知识梳理 专题一 传统发酵技术的应用 1.发酵：通过微生物技术的培养来生产大量 各种代谢产物 的过程。 2.有氧发酵：醋酸发酵；谷氨酸发酵； 无氧发酵： 酒精 发酵；乳酸发酵。 果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作比较 内容 项目 果酒和果醋的制作 腐乳制作 制作泡菜 并检测亚硝酸盐含量 主要微生 物 果酒：酵母菌（1825） 果醋：醋酸菌（3035） 毛霉等（1518） 乳酸菌 原理 酵母菌在无氧条件下将葡萄糖 分解成乙醇 醋酸菌在有氧条件下将糖或乙 醇氧化为醋酸 毛霉等微生物将蛋白质、脂 肪分解成小分子有机物。 蛋白质小分子肽+氨基酸 脂肪甘油+脂肪酸 无氧条
2、件下，乳酸菌将糖转化 为乳酸 原料选择 新鲜葡萄（或苹果） 豆腐 大白菜、花椰菜等新鲜蔬菜 实验 流程 操作注意 事项 材料选择与处理 防止发酵液被污染 控制好发酵条件 控制材料用量 防止杂菌污染 泡菜坛的选择 腌制条件（无氧） 共同点 利用了微生物新陈代谢过程中代谢产物的作用或直接获取代谢产物 制作果酒、果醋、腐乳和泡菜的菌种比较 课题一 果酒和果醋的制作(P2) 1.有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，目的是 大量繁殖 。 反应式为：C6H12O66H2O6O26CO212H2O+能量 在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵，产生 酒精和 CO2 反应式为：C6H12O62C2H5OH2CO2+能
3、量 2.在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在 葡萄皮 表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着 酒精浓度 的 2 提高,红葡萄皮的 色素 也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色。在缺氧呈酸性的发酵液中， 酵母菌 可以生长繁殖，而绝大 多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。 3.果酒和果醋发酵装置设计 装置图 结构 作用 充气口 醋酸发酵时连接充气泵，输入无菌空 气；制酒时关闭充气口 排气口 用来排出CO2 长而弯曲的胶管 防止空气中微生物的污染 出料口 便于取料，及时监测发酵进行的情况 4.当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的 糖 分解成 醋酸 ；当缺少糖源时，醋酸菌将 乙醇 变
4、为 醋酸 ， 具体过程：先将 乙醇 变为 乙醛 ，再将乙醛变为 醋酸 。反应式为：C2H5OHO2CH3COOHH2O+能量 5.控制发酵条件的作用：醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气， 也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为 3035 ，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的 机会。有两条途径生成醋酸：直接氧化和以 乙醇 为底物的氧化。 如何检测生成了醋酸：观（菌膜）、闻、尝； 测发酵前后的 pH 等 6.酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用 重铬酸钾 来检验。在 酸性 条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现 灰 绿 色。先在试管中加入发酵液
5、2L，再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO4 3 滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重 铬酸钾溶液 3 滴，振荡试管，观察颜色。 疑难解答 你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？ 如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需 拧松 瓶盖。 制葡萄酒时，为什么要将温度控制在 1825？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在 3035？ 20左右最适合酵母菌的繁殖，因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最
6、适生长温度为 3035，因此要将温度控制在 3035。 为什么发酵瓶不能装满葡萄汁？ 葡萄汁装入发酵瓶时要留大约 1/3 的空间，目的是 既有利于酵母菌进行有氧呼吸而大量繁殖，又能防止发酵旺盛 时汁液溢出 ；发酵时应先 通入空气 ，目的是 让酵母菌进行有氧呼吸而大量繁殖 ，然后再 隔绝空气，进行无氧发酵 产生酒精。 易混易错 发酵利用的菌种并非都是厌氧微生物。酵母菌是 兼性厌氧型 微生物，醋酸菌和毛霉都是 需氧型 微生物。 发酵利用的是 微生物 的呼吸作用，不只是细菌的呼吸作用。 发酵微生物细菌，如酵母菌、毛霉等也都是发酵常 用菌种。利用葡萄发酵产生果酒的后期，加入醋酸菌即可产生醋酸（ ）。
7、对于果酒的自然发酵，冲洗不要反复进行，以免使 野生型酵母菌 数量过少，发酵周期加长，产生的果酒中酒精含 量下降。葡萄酒中红色是葡萄皮中的色素进入发酵液产生的。 发酵中的数字的记忆： 发酵温度（果酒 1825 ，果醋 3035 ）、发酵液装瓶体积不超过瓶身 2/3 、发 酵瓶消毒用体积分数为 70% 的酒精。 课题二 腐乳的制作(P6) 1.多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是 毛霉 。 2.腐乳制作流程 3.酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵 和后期发酵 。 前期发酵的主要作用：1.创造条件让 毛霉在豆腐上 生长。 2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳
8、 成“体”。后期发酵 主要是 酶与微生物 协同参与生化反应的过程。，通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。 4.将豆腐切成 3cm 3cm 1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为 70 左右，水分过多则腐乳 不易成形 。 5.毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 1518，并保持一定的温度。 3 毛霉的来源：.来自 空气 中的 毛霉孢子 直接接种优良毛霉菌种,这样可以 避免其他杂菌的污染， 保证产品的品质 。时间约 5 天。 毛霉的作用：产生蛋白酶，使蛋白质水解；产生脂肪酶，使脂肪水解。 6.加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时 逐层加盐 ，随着层数的
9、加高而 增加盐量 ，接近瓶 口表面的盐要 铺厚 一些。加盐腌制的时间约为 8 天左右。 7.用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长 ，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过 高会抑制酶活性，使腐乳成熟时间延长且影响口味 。 8.食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质； 析出豆腐中水分 ，使豆腐 变硬，在后期制作过程中不易 酥烂； 调味 ，给腐乳以必要的咸味；浸提毛霉菌丝上的 蛋白酶 。 9.配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种 香辛料 配制而成的。卤汤中酒的含量一般 控制在 12% 左右。 10.酒的作用： 抑制微生物的生长 ； 与有机酸结合
10、形成 酯 ，赋予腐乳风味 酒精含量的高低与腐乳后期发 酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也 越大 ，使腐乳成熟期 延长 ；酒精含量过低，蛋 白酶的活性 高 ，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。 11.香辛料的作用： 调制腐乳的风味 防腐杀菌 参与并促进发酵过程 12.防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好 豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过 酒精灯的火焰，防止瓶口被污染 。 疑难解答 豆腐生长的白毛是 毛霉的白色菌丝 。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 为什么要
11、撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？( 盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败 。) 吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什 么？“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的 菌丝 （匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。 课题三 制作泡菜(P9) 1在无氧条件下， 乳酸菌 将糖分解为 乳酸 。反应式为：C6H12O62C3H6O3+能量 。 2乳酸菌比杂菌耐酸，发酵前期数量增多，杂菌减少。 3含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素 能杀死乳酸菌或抑制乳酸菌的生长 。常 见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产 酸奶 。
12、4.煮沸泡菜盐水的目的是除去水中的氧气和杀灭盐水中的杂菌。 5.亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。 6.膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉 中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿 排出体外，但在适宜 pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺 。 7.一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在 10 天之后食用最好。 8.测定亚硝酸盐含量的原理是在 盐酸酸化 条件下，亚硝酸盐与 对氨基苯磺酸 发生重氮化 反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐 结合形成 玫瑰红 色染料，与已知
13、浓度的标准显色液进行 目测 比较-比色法，估算泡菜中亚硝酸盐含量。 9.导致泡菜中亚硝酸盐含量增加的因素有：温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成 细菌 大量繁殖，导 致亚硝酸盐含量增加。 专题二 微生物的培养与应用 课题一 微生物的实验室培养(P14) 1.培养基：人们按微生物对 营养物质 的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础 培养基按照物理性质可分为 液体培养基 、半固体培养基、 固体培养基 。在液体培养基中加入凝固剂 琼脂 （是 从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作 凝固剂 ）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可 以形成肉眼
14、可见的 菌落 。根据菌落的 特征 可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用 于微生物的 分离、计数和鉴定 ，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。 按照化学成分可分为人工合成培养基和 半合成培养基、天然培养基 。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而 成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实 际工业生产。 按照培养基的用途，可将培养基分为 选择培养基 和 鉴别培养基 。 选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以 抑制或阻止 不需要的微生物生长， 促进 所需要的微生物的生长。 4 如：去除
15、培养基中的氮源，可筛选固氮微生物； 以石油为唯一碳源的培养基可用于分离降解石油的微生物。 鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种 指示剂 或 化学药品 配制而成的，用以鉴别不同类别的微生 物。 如：加入伊红美蓝的培养基可用于鉴别大肠杆菌，大肠杆菌在伊红美蓝培养基上形成的菌落呈黑色。 培养基的化学成分包括 C 源 、 N 源 、 水 和 无机盐 、生长因子等。 碳源：能为微生物的代谢提供 C 元素的物质。如 CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养 微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。 氮源：能为微生物的代谢提供 N 元素的物质。如 N2、NH3、N
16、O3 -、NH 4 +（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、 蛋白胨（有机氮源）等。只有 固氮微生物 才能利用 N2。 培养基还要满足微生物生长对 PH、特殊营养物质以及 O2 的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生 素，培养霉菌时须将培养基的 pH 调至 酸性 ，培养细菌是需要将 pH 调至 中性或微碱性 ，培养厌氧型微生物是则需要提 供 无氧 的条件 应用：细菌-牛肉膏蛋白胨培养基、营养琼脂培养基 酵母菌-麦芽汁琼脂培养基 检测水中大肠杆菌含量- 伊红美蓝培养基 植物组织培养-MS 培养基 真菌-马铃薯琼脂培养基 霉菌-查氏培养基 M 培养基 Y 的传代保藏 2.无菌技术：
17、 主要是消毒和灭菌 获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 。 对实验操作的空间、操作者的 衣着和手 ，进行清洁和 消毒 。 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基 等器具进行 灭菌 。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 酒精灯火焰 附近进行。 实验操作时应避免 已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 无菌技术除了用来防止培养物被其他外来微生物污染外，还能有效 避免操作者自身被微生物感染 及避免环境污染。 消毒与灭菌 消毒指使用较为 温和 的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括 芽孢和孢子 ）。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外 所有的微
18、生物 ，包括 芽孢和孢子 。 条件 结果 常用方法 应用范围 消毒消毒 较为温和 的物理或 化学方法 仅杀死物体表面 或内部的部分微 生物 煮沸消毒法 日常用品 巴氏消毒法 不耐高温的液体 化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手； 用氯气消毒水源 实验操作的空间、操作者的衣着和手 紫外线消毒 （紫外灯） 杀死物体表面和空气中的微生物 灭菌灭菌 强烈的理 化因素 杀死物体内外所 有的微生物，包 括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 （酒精灯外焰） 接种环、接种针、试管口等 干热灭菌法 （干热灭菌箱） 玻璃器皿、金属用具 高压蒸汽灭菌法 （高压蒸汽灭菌锅） 培养基、无菌水等 3制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 方法步骤：计
19、算称量溶化调 pH灭菌倒平板。 倒平板操作的步骤 将灭过菌的培养皿放在 酒精灯火焰 旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过 火焰 。 用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 1020mL）倒入培养皿， 左手立即盖上培养皿的皿盖。 等待平板冷却凝固，大约需 510min。然后，将平板 倒置 放置，使培养皿盖在下、皿底在上。 倒平板操作的讨论 培养基灭菌后需要冷却到 50 左右时才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到 刚刚不烫手时 ，就可以进行
20、倒平板了。 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？(答： 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 。) 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以 防止皿盖上的 水珠落入培养基，造成污染 ；又可以避免培养基中的水分过快蒸发。 5 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 答：不能 。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，故 最好不要用 这个平板培养微生物。 4纯化大肠杆菌 微生物的分离纯化培养技术 目的：在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体菌落。
21、纯化培养方法 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 一系列的梯度稀释 涂布平板法操作 注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环并冷却 稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加 稀释度的范围 菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数 缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板 微生物接种的核心是 防止杂菌污染 ，保证培养物的纯度。 微生物接种的方法最常用的是 平板划线 法和 稀释涂布平板 法。 用平板划线法和稀释涂布平
22、板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成 单个细胞 ，从而能在培养基表面 形成单个的菌落 ，以便于 纯化菌种 。 平板划线法 通过接种环在琼脂 固体 培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种 逐步稀释 分散到培养基的表面。在 数次划线后培养，可以分离到由 一个细胞 繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是 菌落 。 平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在 火焰 旁冷却接种环， 并打开棉塞。 将试管口通过 火焰 。将已 冷却 的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过 火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五 条平行线，盖上
23、皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的 末 端开 始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区 相连 。将平板 倒置 放入 培养箱 中培养。 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到 琼脂固体培养基 的表面，进行培养。分为系列 稀释操作 和 涂布平板操作 两步。 稀释操作的步骤：1mL 某液+9mL 无菌水某液被稀释 10 倍 涂布平板操作的步骤：将 涂布器 浸在盛有酒精的烧杯中。 取少量菌液，滴 加到培养基表面。 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810s。 用
24、 涂布器 将菌液 均匀 地涂布在培养基表面。 平板划线操作的讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 ；每次划线前灼烧接种环是为了杀 死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的 末端 ，从而通过划 线次数的增加，使每次划线时菌种的数目 逐渐减少 ，以便得到 菌落 。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残 留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？（答：
25、 避免接种环温度太高而杀死菌种。） 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要 少 ，每次从上一次划线的 末端 开始，能使细菌的数目随着划 线次数的增加而逐步减少，最终能得到由 单个细菌 繁殖而来的 菌落 。 涂布平板操作的讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2 步应如何进行无 菌操作？（提示：应从操作的各个细节保证 “无菌” 。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物 体、吸管要在酒精灯火焰周围等。） 5菌种的保存 临时保藏 对于 频繁使用
26、 的菌种，可以采用 临时保藏 的方法。 临时保藏方法 将菌种接种到试管的 固体斜面培养基 上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 4的 6 冰箱中保藏。以后每 36 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。缺点：这种方法保存的时间不长， 菌种容易被污染或产生变异。 甘油管藏 对于需要 长期保存 的菌种，可以采用 甘油管藏 的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。 将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在 20 的 冷冻箱 中保存。 疑难解答 生物的营养 营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、
27、生殖所需的 外源物质。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二 氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。 确定培养基制作是否合格的方法 将 未接种 的培养基在 恒温箱 中保温 12 天， 无菌落生长 ，说明培养基的 制备是成功的，否则 需要重新制备 。 课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(P21) 尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿分解成 氨 之后才能被植物利 用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成 脲酶 。尿素最初是从人的尿液中发现的 1.筛选
28、菌株 （1）实验室中微生物的筛选应用的原理：人为提供 有利于目的菌株生长的条件 （包括 营养、 温度、 pH 等），同时 抑制或阻止其他微生物生长 。 （2）选择性培养基：在微生物学中，将允许 特定种类的微生物生长 ，同时 抑 制 或 阻止 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 （3）配制选择培养基的依据：根据选择培养的菌种的 生理代谢特点 加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基 中不加入有机物可以选择培养 自养型 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能 固氮 的微生物；加入高浓度的 NaCl 溶液 可选择培养金黄色葡萄球菌等。 2.统计菌落数目 微生物的计数 比较项目 间接
29、计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法 (显微镜直接计数) 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于 样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出 样品中大约含有少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数 板，在显微镜下计算一定容积的样品中 微生物的数量 公式 每克样品中的菌株数： （ ） 。：某一稀释度 下平板上生长的平均菌落数；：涂布平板时所用的稀释液的体积 （）；：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格平 均细菌数 稀释倍数 缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌 落，计数结果比实际值偏小 不能区分死细胞和活细胞，计数结 果比实际值偏大 测
30、定微生物数量的常用方法有 稀释涂布平板法 和 显微镜直接计数（用血细胞计数板 或 细菌计数板）、滤膜法 （如测定饮用水中大肠杆菌的数目）。 稀释涂布平板法统计样品中 活 菌的数目的原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个 菌落 ，来源 于样品稀释液中的 一个活菌 （所以 恰当的稀释倍数 是成功地统计菌落数目的关键）。通过统计平板上的菌落数，就能 推测出样品中大约含有多少 活细菌 。 为了保证结果准确，一般设置 35 个平板（设置重复组，增强实验的说服力与准确性），选择菌落数在 30300 的平板进行计数，且不同平板之间菌落数差异不大，用其 平均值 作为估算的最终结果。 若菌落数差异较
31、大，应 重 复实验 找出原因。 稀释涂布平板法 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 低 ，因为当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一 个菌落，而且培养过程中部分菌会死亡。而 显微镜直接计数法 不 能 区 分 死 细 胞 和 活 细 胞，计数结果比实际值偏大。 统计结果一般用 菌落数 而不是活菌数来表示。 3.设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中 非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实 验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实 是所测试的条件引起相应的结果。 4.实验设计 实验设计包括实验方案，所需仪器
32、、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。 7 土壤取样：在富含 有机质 的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7 的土壤中取样。铲去 表层土，在距地表约 38cm 的土壤层取样。 样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的 菌落数目 。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品 液进行培养，以 保证获得菌落数在 30300 之间、适于计数的平板 。测定土壤中细菌的数量，一般选用 104、105、106； 测定放线菌的数量，一般选用 103、104 、105； 测定真菌的数量，一般选用 102、103、104。 微生物的培养与观察: 不同种类的微生
33、物，往往需要不同的培养 温度 和培养 时间 。细菌 3037 12 天，放线 菌 2528 57 天， 霉菌 2528 34 天 。 每隔 24 小时统计一次 菌落数目 ，选取 菌落数目稳定时 的记录作为结果，这样可以 防止因培养时间不足 而导致遗漏 菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。 菌落特征菌落特征如 菌落的形状 、大小、 隆起程度 、颜色。举例：在伊红美蓝培养基上大肠杆菌菌落呈黑色有金属光泽。 课题三 分解纤维素的微生物的分离(P27) 纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
34、 1.纤维素与纤维素酶 棉花 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。 纤维素酶是一种 复合酶，它至少包括三种组分，即 C1 酶、 CX 酶和 葡萄糖苷酶 ，C1 酶和 CX 酶使 纤维素 分解 成 纤维二糖， 葡萄糖苷酶 将 纤维二糖 分解成 葡萄糖 。纤维素最终被水解成 葡萄糖，为微生物的生长提供营养。 2.纤维素分解菌的筛选 筛选方法： 刚果红 染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。 刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成 红色复合物 ，但 并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的
35、培养基中 加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素 酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以 纤维素分解 菌 为中心的 透明圈 。这样，我们就可以通过 是否产生透明圈 来筛选纤维素分解菌。 3.分离分解纤维素的微生物的实验流程 土壤取样 选择培养 （此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定） 梯度稀释 将样品涂布到鉴 别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落 土壤采集 选择富含纤维素的环境。 刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、 稀释涂布 刚果红染色法种类 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一
36、种是 在倒平板时就加入刚果红 。 疑难解答 为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 由于生物与环境的相互依存关系， 在富含纤维素的环境中， 纤维素分解菌的含量相对提高 ，因此从这种土样中获 得目的微生物的几率要高于普通环境。 将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 将滤纸埋在土壤中 能使纤维素分解菌相对聚集 ，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于 深约 10cm 左右腐殖土壤中。 为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物 得到迅速繁殖 ，而那些不适应这种营养条件的微 生物的 繁殖被抑制
37、，因此可以起到“浓缩”的作用。 选择培养的目的： 增加纤维素分解菌的浓度，确保能从样品中分离到所需的微生物 。 专题六 植物有效成分的提取 植物有效成分的提取方法比较 提取方法 实验原理 方法步骤 适用范围 水蒸气蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的 芳香油携带出来 水蒸气蒸馏分离油层除水过 滤 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强 的芳香油 8 压榨法 通过机械加压，压榨出果皮 中的芳香油 石灰水浸泡漂洗压榨、过 滤、静置再次过滤 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取 有机溶剂萃取 使芳香油溶解在有机溶剂 中，蒸发溶剂后就可获得芳香油 粉碎、干燥萃取、过滤浓缩 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能 细小
38、，能充分浸泡在有机溶剂中 课题一 植物芳香油的提取(P72) 天然香料的来源：植物、动物。 不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。 芳香油的提取方法： 蒸馏法 ， 压榨法 ， 萃取法 等。 芳香油的性质： 挥发性强 ，成分复杂 ，以 萜类化合物及其衍生物 为主。 1水蒸气蒸馏法 原理：水蒸汽可将 挥发性较强 的芳香油携带出来形成 油水混合物 ，冷却后水油分层。 方法： 水中 蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏； 水上 蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏； 水气 蒸馏：利用外来高 温水蒸气加热蒸馏。 不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等 原料易焦糊 ，有效成分会水解 。通常用 压
39、榨 法（通过机械压 缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作）。 玫瑰精油的提取 0.1g/mL 氯化钠溶液的作用： 增加水层密度，促进油和水分离 。 无水硫酸钠的作用： 吸收油层中的水分 。 实验步骤：采集玫瑰花：采集 盛开 期的玫瑰花，清水清洗沥干。 装入蒸馏原料：称取 50g 玫瑰花放入蒸馏 瓶，添加 200mL 蒸馏水。 安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上 次序安装水蒸气蒸馏装置。 加热蒸馏：控制蒸 馏 速度 （12 滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。 分离油层：向乳浊液加入 NaCl 溶液后，利用 分液漏斗 分离出上面的油层。 除去水分：向油层中加入 无水硫酸钠 ，
40、24h 后过滤，得到玫瑰油。 注意事项：蒸馏时间不能 太短 ，温度不能 太高 。 2.压榨法 橘皮精油的提取 橘皮精油的主要成分： 柠檬烯 ，主要分布在 橘皮 中。 石灰水浸泡：防止 橘皮压榨时滑脱 ，提高 出油率 ，降低压榨液 黏稠度 ，过滤 不堵塞筛眼 。 小苏打、硫酸钠：促进 油与水 的分离（用量分别为橘皮质量的 0.25和 5）。 实验步骤：橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗 沥干 。 石灰水 浸泡：用 78石灰水浸泡橘皮 24h。 流水 漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。 粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压 榨机压榨得到压榨液。 过滤 压榨液：用布袋过滤，滤液
41、再高速离心处理，分离出上层橘皮油。静置处理：将橘皮 油在 510冰箱中静置 57d，分离出上层澄清橘皮油。 静置处理目的： 除去果蜡和水分 。 再次过滤：将下层橘皮 油用 滤纸 过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。 3.萃取法 原理：芳香油 易 溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。 溶剂：如石油醚、酒精、乙醚等。 方法：原料浸泡在溶剂中得到浸泡液有机溶剂挥发芳香油。 不足：有机溶剂中的 杂质 影响芳香油的品质 9 课题二 胡萝卜素的提取（ 萃取法 ）(P77) 1胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定不溶于 水 ，微溶于 乙醇 ，溶于 石油醚 等有机溶剂。 依据 碳碳双键 的数目划分
42、为、 三类。其中最主要的组成成分为 -胡萝卜素 。 作用：治疗 夜盲 症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；常用于食品色素； 使癌变细胞恢复成正常细胞。 提取胡萝卜素的方法主要有三种：从 植物 中提取 从大面积养殖的 岩藻 中获得 利用 微生物的发酵 生产 2实验步骤：粉碎 干燥 萃取 过滤 浓缩 3萃取剂： 水溶性的：乙醇、丙酮；水不溶性的： 石油醚 、 乙酸乙酯 、 乙醚、苯、四氯化碳等 萃取胡萝卜素的有机溶剂应具有 较高的沸点 （加热萃取时不易挥发）， 能够充分溶解胡萝卜素 ， 且不与水混溶。 此外，还要考虑萃取效率、对人的毒性、是否易燃、有机溶剂能否从产品中完全除去等问题。最理想的萃取剂
43、是 石油醚 4影响萃取的因素 主要因素：萃取剂的 性质 和 使用量 。 次要因素：原料颗粒的 大小、紧密程度、含水量、萃取的 温度 和 时间 等 一般来说，原料颗粒 小 ，萃取温度 高 ，时间 长 ，需要提取的物质就能够 充分溶解 ，萃取效果就 好 。萃取 前，要将胡萝卜进行 粉碎 和 干燥 5胡萝卜素提取 萃取过程应该避免 明火 加热，采用 水浴 加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃 烧爆炸。 为了 防止加热时有机溶剂挥发 ，还要在加热瓶口安装回 流冷凝装置 。 萃取液的浓缩可直接使用 蒸馏装置 。在浓缩之前，还要进行 过滤 ， 除去萃取液中的不溶物 。 6.鉴定：
44、纸层析法 滤纸： 18 30 。 基线：滤纸下端距底边 2 处做一基线在基线上取 A、 B、 C 、 D 四点。 点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取 标准样品 和 提取样品 ，分别在 A、D 和 B、C 点进行点样。 等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成 圆筒 状，至于装有深的 石油醚 的密封玻璃瓶中。等各种 色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。 7乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？ 答：不能，因为乙醇和丙酮 是水溶性有机溶剂 ，萃取中能与水混溶而影响 萃取效果 ，所以不用它们作萃取剂。 8.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，
45、哪种最适宜用来提取胡萝卜素？ 答：石油醚的 沸点最高 ，在加热萃取时 不易挥发 ，所以石油醚最适宜用作萃取剂。 专题 4 酶的研究与应用(P41) 酶 的 研 究 与 应 用 果胶酶在果汁 生产中的应用 果胶酶的作用 酶的活性 是指酶催化一定化学反应的能力 影响因素:温度pH;酶的抑制剂 实验探究果胶酶的用量 探讨加酶洗衣粉 的洗济效果 含有酶制剂的洗衣粉 酶制剂:蛋白酶;脂肪酶;淀粉酶;纤维素酶 加酶洗衣粉 实验探究:普通洗衣粉与加酶洗衣粉的区别 酵母细胞的固定化 固定化酶的应用实例:高果糖浆的生产 固定化细胞技术:包埋法;化学结合法;物理法 制备固定化酵母细胞 10 1.果胶是是植物 细胞
46、壁 及 胞间层 的主要组成成分之一，是由 半乳糖醛酸 聚合而成的一种高分子化合物， 不溶于 水 。在果汁加工中，果胶不仅影响出汁率，还会果汁浑浊。 2.果胶酶能分解 果胶 ，从而能提高 出汁率 并使 果汁变得澄清 。食品工业中的果胶酶主要来源于 霉菌 发酵生产。 3.果胶酶将果胶分解成 半乳糖醛酸 （溶于水）。果胶酶包括 多聚半乳糖醛酸酶 、 果胶分解酶 和 果胶酯酶 等。 4.酶的活性是指 酶催化一定化学反应的能力 。酶反应速度用单位时间内单位体积中反应物的减少量或生成物的增加 量来表示。 5.加酶洗衣粉中的酶制剂有 蛋白酶 、脂肪酶 、 淀粉酶 、 纤维素酶 。其中，应用最广泛、效果最明显
47、的是 碱性 蛋白酶 和 碱性脂肪酶 。 6.提高酶的利用率的技术： 固定化酶技术。 7.固定化酶和固定化细胞技术是利用 物理 或 化学 方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括 包埋法 、 化学 结合法 、物理吸附法 。 8.固定化酵母细胞的操作中，海藻酸钠的作用：作包埋剂，包埋酵母菌。CaCl2的作用是：作凝固剂，与海藻酸钠反应 形成凝胶珠。 影响酶活性的因素（温度、pH 等)：如探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果，实验变量为洗涤剂，设 计时应遵循单一变量原则、对照性原则有效的控制其他变量，如水的用量、污染物的量，所用实验用布的质地大小、两种 洗衣粉的用量，搅拌及洗涤时间。 专
48、题 5 课题 3 蛋白质的提取和分离(P64) 1.蛋白质分离的依据：蛋白质 各种特性 的差异，如分子形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和 对其他分子的亲和力等。 2.蛋白质分离的方法：凝胶色谱法、电泳法。 3. 凝胶色谱法也称 分配色谱法 ，是根据 相对分子质量的大小 分离蛋白质的有效方法。 4.凝胶的实际上是一些 微小的多孔球体 ，大多是由 多糖类化合物 构成的如 葡聚糖 或 琼脂糖 ，其内部有多贯穿 的 通道 ，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 较长， 移动速度 较慢 ，故 后 洗脱出来；而相对分子质量 较大 的蛋白质无法进入 凝胶内部的通道，只能在凝胶 外部 移动， 路程 较短 ，移动速度 较快 ，故 先 洗脱出来。 5.电泳法： 带电离子在电场 的作用下发生 迁移
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